PCR擴(kuò)增目的基因

王瑞斌1，黃浩哲2

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)，2021級口腔20210499120011)

(2. 西南醫(yī)科大學(xué)，2021級口腔20210499120017）

摘要：目的：通過PCR技術(shù)對目的基因LDH-B進(jìn)行擴(kuò)增，再通過瓊脂糖凝膠電泳中的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與maker條帶進(jìn)行對比，觀察條帶位置從而判斷目的基因是否擴(kuò)增成功，熟悉掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)原理，了解PCR擴(kuò)增引物設(shè)計的原理和方法。結(jié)果：電泳條帶清晰，各條帶分明，見少許拖影現(xiàn)象，泳道見一明一暗兩條明顯條帶，較淺條帶分子量與目的基因相同。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增目的基因，但條帶不清晰，二者灰度值差異明顯，可能與引物量太多、引物特異性太弱、酶活性降低或PCR程序設(shè)計不合理等原因相關(guān)。

Abstract: Objective: To amplify the target gene LDH-B by PCR technique, and then compare the amplified product bands with maker bands in agarose gel electrophoresis, observe the position of the bands to determine whether the target gene is amplified successfully, to be familiar with the experimental techniques and principles of polymerase chain reaction (PCR), and to understand the principles and methods of PCR amplification primer design. Results: The electrophoretic bands were clear, each band was distinct, a little trailing phenomenon was seen, two obvious bands were seen in the lane, and the molecular weight of the lighter band was the same as the target gene. Conclusion: The experiment successfully amplified the target gene, but the bands were not clear, and the difference between the two grayscale values was obvious, which might be related to too many primers, too weak primer specificity, reduced enzyme activity or unreasonable PCR program design.

關(guān)鍵詞：PCR；目的基因；電泳

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

上游引物：LDH-B F 5'-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3'

下游引物：LDH-B R 5'-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3'

將這兩條引物序列送生物技術(shù)公司合成引物，收到公司合成的引物后分別用滅菌雙蒸水配為10μM引物溶液。

Taq polymerase（天根生化科技有限公司）。

10×TBE電泳緩沖液（pH8.3）：取Tris 108g，Na2EDTA?2H2O 7.44g，硼酸55g置于1L燒杯中，向燒杯中加入約800mL純水，充分?jǐn)嚢枞芙狻Ｓ眉兯ㄈ葜?L后，室溫保存。1×TBE電泳緩沖液由10×TBE電泳緩沖液稀釋而來（可稀釋至0.5×TBE使用），用作配制瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液。

6×上樣緩沖液：稱取溴酚藍(lán)（bromophenol blue）50mg，二甲苯青（xylene cyanol FF）50mg，EDTA 0.88g置于100mL燒杯中，向燒杯中加入40mL純水，加熱攪拌充分溶解；加入36mL甘油（Glycerol）后，使用2N NaOH調(diào)pH至7.0；用純水定容至100mL，室溫保存。

10mg/mL EB溶液：戴手套謹(jǐn)慎稱取溴化乙錠（ethidium bromide，EB）200 mg 于棕色試劑瓶中，加20mL雙蒸水，充分溶解后室溫避光保存。EB的工作濃度為 0.5g/mL，也可用10mg/mL EB溶液配制5g/mL的EB染色液。EB是一種致癌物質(zhì)，操作必須小心。

電泳儀、水平電泳槽、移液器、吸頭、1.5mL Eppendorf管（EP管）、一次性手套、錐形瓶、100mL量筒、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、掌式高心機(jī)、基因擴(kuò)增儀

1.2 方法

1.2.1 PCR反應(yīng)體系的準(zhǔn)備

向容積為2.5ml的PE管中依次加入PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template各2.5μl及ddH2O10μl。其中，加入ddH2O時使用量程為10μl的移液槍，其余試劑使用量程為2.5ml的移液槍加入。將PE管瞬時離心10s。

1.2.2 PCR反應(yīng)程序的設(shè)置

將PE管放置于PCR儀后設(shè)定如下循環(huán)：（1）95℃，30s；（2）60℃，30s（3）72℃，30s?？偣惭h(huán)28次。

1.2.3 瓊脂糖凝膠的制備

使用微波爐（中高火）加熱瓊脂糖（2~3min）至清澈透明的溶液，然后用自來水沖洗冷卻至約60℃；將瓊脂糖溶液倒入制膠模具中，凝膠厚度約5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡；凝膠完全凝固后，移去梳子。

1.2.4 加樣

PCR結(jié)束后，取出樣品，加入5μl 6×loading buffer后混勻，瞬時離心，再將10μl混勻樣品加入到瓊脂糖凝膠樣品孔內(nèi)。將托盤和凝膠放入電泳槽，注意點(diǎn)樣端放置于靠近負(fù)極。TBE緩沖液恰好沒過膠面約1mm。

1.2.5 電泳

調(diào)節(jié)電壓為130V，電流為0.6mA，通電。待條帶區(qū)分開后關(guān)閉電源。

1.2.6 染色

EB染色3min，自來水清洗一次

1.2.7 觀察

凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

2 結(jié)果與討論

2.1結(jié)果

樣品在經(jīng)過染色后呈現(xiàn)出兩個清晰的條帶，下方的一條較為明顯，上方一條較為暗淡。（如圖1）

圖一 電泳結(jié)果

2.2關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論

2.2.1 瓊脂糖凝膠的制備

瓊脂糖凝膠的內(nèi)部空隙均勻一致性是電泳條帶整齊均一不出現(xiàn)偏斜的前提，若在制膠時出現(xiàn)未完全溶解就將凝膠倒入平板，會出現(xiàn)凝膠的部分區(qū)域空隙大小不一從而導(dǎo)致電泳物質(zhì)的移動速度不一致，出現(xiàn)條帶便宜。瓊脂的濃度和電泳帶位移速度成負(fù)相關(guān)。

2.2.2 PCR體系的制備

PCR有固定的反應(yīng)體系成分，包括PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer R、Taq polymerase、cDNA template等各種成分，還有固定體積，通常用ddH2O配到反應(yīng)體系，加量需準(zhǔn)確無誤，并且避免污染。

2.2.3 電泳條帶

影響DNA條帶扭曲的因素包括電泳緩沖液的種類和濃度、環(huán)境溫度、凝膠的均一性、瓊脂糖的生產(chǎn)質(zhì)量[1]。也與上樣相關(guān)，若不小心破壞了凝膠，也會產(chǎn)生條帶的扭曲。該實(shí)驗(yàn)中下方的條帶較上方更明顯更亮，二者灰度值差異明顯，可能是因?yàn)橐锪刻?、引物特異性太弱、酶活性降低或PCR程序設(shè)計不合理等原因，從負(fù)極往正極分別為DNA產(chǎn)物及引物二聚體。

2.2.4 PCR引物設(shè)計原則

①引物與引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu), 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。②在選擇用來擴(kuò)增不同物種DNA的引物時, 應(yīng)避開m RNA的5′和3′末端非翻譯區(qū)序列。③引物長度以及GC含量合適以保證合適的Tm值。④引物3′端不能選擇A, 最好選擇T。⑤引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有其他相似性較高的序列。⑥引物5′端可以修飾, 3′端不可修飾且要避開密碼子第3位[2]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對LDH-B基因的擴(kuò)增及檢測，熟悉并練習(xí)了實(shí)驗(yàn)的操作過程，對實(shí)驗(yàn)中可能存在的問題和需要注意的細(xì)節(jié)進(jìn)行了分析，之后對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了思考，分析了實(shí)驗(yàn)中各種因素的干擾和影響，鍛煉了學(xué)生的思考能力，通過課后的文獻(xiàn)及資料查詢解決問題，既提高了學(xué)生的動手能力也同時反思糾錯的能力，對于建立良好的科研思考模式有較大幫助。

[1]劉陽,楊淑霞,賴翼,李敏惠,胡松,鄒強(qiáng).影響瓊脂糖凝膠電泳條帶扭曲程度的因素[J].生物學(xué)雜志,2009,26(02):70-72.

[2]尤超,趙大球,梁乘榜,周春華.PCR引物設(shè)計方法綜述[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2011(17):48-51.